免疫检查点分子是调节免疫应答激活与抑制平衡的关键分子。在正常生理状态下，抑制性免疫检查点在自身耐受和自身免疫防御中发挥重要作用，但在肿瘤患者中，抑制性免疫检查点表达上调，导致免疫逃逸。例如，抑制性免疫检查点CD274（也称为PD-L1）与T细胞上的程序性细胞死亡（PD）-1受体相互作用以抑制T细胞活化，在许多癌症中过表达。目前，通过阻断这些相互作用来进行癌症治疗效果显著，但具体调控机制尚不明确。

近日，来自纽约大学基因组和系统生物学中心的Rahul Satija课题组的研究人员在《Nature Genetics》上发表了题为Characterizing the molecular regulation of inhibitory immune checkpoints with multimodal single-cell screens的研究成果，其开发了一种新型单细胞测序技术，识别和验证PD-L1的转录和转录后调控模式，从而确定了一种调节免疫检查点的新机制。

DOI: 10.1038/s41588-021-00778-2

通常癌细胞通过上调免疫检查点分子（如PD-L1）逃避免疫监视，阻断该过程可显着增强抗肿瘤免疫反应，特别是在免疫治疗期间。因此，亟需对抑制性免疫检查点表达调控进行深入研究。

为了开发一个可以同时研究多个免疫检查点的实验系统，研究人员筛选了四种癌细胞系（THP-1，K562，KG-1和U93），测试它们在应答中上调免疫检查点的能力。结果发现，使用IFN-γ、地西他滨（DAC）和转化生长因子（TGF）-β1刺激THP-1细胞，可以显著诱导三个免疫检查点表达：PD-L1，PD-L2和CD86。随后，研究人员将CRISPR兼容性CITE-seq技术相结合，新开发了ECCITE-seq技术，同时测量细胞转录组以及PD-L1、PD-L2和CD86的表面蛋白水平，并检测gRNA。

CITE-seq和ECCITE-seq识别PD-L1表达调控

为了鉴定免疫检查点的调节剂，研究人员将刺激和未刺激的THP-1细胞进行CITE-seq，发现200个与PD-L1表达相关的基因，8个具有调节作用的基因，以及其他18个基因，包括转录因子、染色质调节剂、信号调节剂和蛋白质稳定调节剂。此外，ECCITE-seq技术可对免疫检查点调节剂进行验证。

ECCITE-seq数据集UMAP可视化

并且，研究显示出两组分界清晰的细胞群，一群细胞表达干扰IFN-γ上游分子（IFNGR1，IFNGR2，JAK2，STAT1），另一群细胞缺乏IRF1编码的IFN-γ下游分子。随后，研究人员发现CUL3和BRD4是PD-L1表达的负调控因子，干扰CUL3-KEAP1复合物可抑制NRF2泛素化，从而促进PD-L1转录表达，也就是说CUL3–KEAP1复合物是PD-L1的间接调节剂。

CUL3-KEAP1复合物通过NRF2间接调节PD-L1

简而言之，研究人员通过将CRISPR筛选与单细胞mRNA和表面蛋白检测相结合，开发了CRISPR兼容CITE-seq技术，发现PD-L1的多种调节剂，并且揭示一种调节免疫检查点的新机制。更重要的是，该研究推出了一种强大的分析技术，将极大的推动未来多模式单细胞研究。