TUNEL检测细胞凋亡原理

一、TUNEL核心概括

TUNEL 是一种用于在细胞或组织切片中特异性检测细胞凋亡过程中DNA断裂的分子生物学技术。它的名字是一个缩写：

   T - Terminal：末端的

   dU - Deoxyuridine：脱氧尿苷

   N - Nick：缺口

   E - End：末端

   L - Labeling：标记

顾名思义，它的核心就是标记DNA的断裂末端。

二、详细原理

细胞凋亡最关键的特征性事件之一是细胞核内的DNA发生有规律的断裂。这个过程主要分为两步：

1.  DNA被内切酶切割成50-300 kb的大片段。

2.  进一步在核小体连接处被切割，产生大量长度为180-200 bp整数倍的DNA片段，在凝胶电泳上呈现特异的“梯状”条带。

TUNEL技术正是利用了第二步中产生的大量DNA断裂末端。

三、基本原理步骤

1.  固定与通透：

       首先，将细胞或组织切片进行固定，以保持其形态。

       然后用通透剂处理，使细胞膜和核膜产生小孔，允许后续的试剂进入细胞核。

2.  酶促反应 - 核心步骤：

       向样本中加入一种特殊的酶——末端脱氧核苷酸转移酶。

       同时，加入被标记物标记的dUTP。这个标记物可以是：

           荧光素，如FITC，用于荧光显微镜观察。

           生物素 或 di高辛，用于后续与酶联抗体反应，产生颜色信号。

       TdT酶的作用：TdT酶能够识别并结合到DNA双链或单链的3'-OH末端。在细胞凋亡中，这些末端被大量暴露出来。TdT酶会将标记好的dUTP一个一个地添加到这些3'-OH末端，形成一个多聚的标记核苷酸链。

3.  信号检测：

       如果dUTP是荧光标记的：直接在荧光显微镜下观察，发出荧光的细胞核即为凋亡细胞。

       如果dUTP是生物素等di高辛标记的：则需要加入与标记物结合的酶联抗体，然后加入底物产生不溶性的有色沉淀，在普通光学显微镜下观察，细胞核被染色的即为凋亡细胞。

四、 TUNEL法的关键特点

 优点：

1.  高特异性与直观性：能够直接在组织原位或细胞水平上定位发生凋亡的单个细胞，并观察其形态学变化。

2.  高灵敏度：由于凋亡中期会产生海量的DNA断裂点，因此信号非常强，易于检测。

3.  广泛应用：可用于石蜡包埋组织切片、冰冻切片、细胞涂片等多种样本。

 缺点与注意事项：

1.  并非绝对特异：

       主要问题：在某些情况下，细胞坏死 也会导致DNA随机断裂，产生3'-OH末端，从而造成假阳性 结果。

       自噬 等其它细胞死亡方式也可能导致DNA损伤。

2.  依赖样本质量：组织处理不当或DNA的机械性损伤也可能产生假阳性。

3.  成本较高：试剂盒价格通常比较昂贵。

五、如何区分凋亡与坏死？

正因为TUNEL有假阳性的风险，在实验中必须结合细胞形态学观察来综合判断：

   凋亡细胞的典型形态：

       细胞核：染色质固缩、边缘化，核膜裂解，细胞核分裂成碎片。

       细胞质：浓缩，细胞器保持完整。

       细胞膜：起泡，形成凋亡小体。

       周围组织：无炎症反应。

   坏死细胞的典型形态：

       细胞核：早期可能肿胀，后期染色质DNA随机降解，核溶解。

       细胞质：肿胀，细胞器破坏。

       细胞膜：破裂，内容物泄漏。

       周围组织：伴有明显的炎症反应。

 总结

TUNEL法的原理是利用凋亡过程中产生的海量DNA断裂末端，在TdT酶的作用下，将标记过的核苷酸连接到这些末端，从而通过检测标记信号来原位、特异性地显示发生凋亡的细胞。

在实际应用中，绝不能仅凭TUNEL阳性就断定细胞凋亡，必须结合细胞核形态学特征（染色质固缩、核碎裂等） 进行综合判断，或者与其他凋亡检测方法（如Annexin V/PI流式细胞术、Caspase-3活性检测等）联合使用，才能得出可靠的结论。

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