DMSO细胞冻存液概述

关于DMSO细胞冻存液，这是一个细胞实验中最基础也最关键的技术之一。

一、核心概述

DMSO细胞冻存液是一种用于在超低温（通常是-196°C的液氮或-150°C的超低温冰箱）下长期保存细胞的溶液。其核心成分是细胞培养液和冷冻保护剂，其中最常用的冷冻保护剂就是二甲基亚砜。

 二、为什么要用DMSO？（作用原理）

细胞在低温冷冻时，主要面临两大致死威胁：

1.  冰晶的形成：细胞内外的水分会形成冰 晶，这些尖锐的冰晶会刺破细胞膜和细胞器，导致细胞死亡。
2.  溶液效应：当水结冰时，细胞内外未结冰的溶液中溶质（盐、离子等）浓度会急剧升高，产生高渗环境，导致细胞脱水、蛋白质变性，造成化学损伤。

DMSO的作用就在于：
   降低冰点：DMSO与水分子结合，降低了水的冰点，使细胞在更低的温度下才结冰。
   减少冰晶：它能让水在结冰时形成更细小的冰晶，甚至实现“玻璃化”（一种非晶态的固态），从而最大限度地减少冰晶对细胞的物理损伤。
   平衡渗透压：DMSO能穿透细胞膜，使细胞内外在冷冻过程中渗透压趋于平衡，减少细胞的过度脱水。

简单来说，DMSO就像细胞的“防冻液”，保护细胞在冷冻和解冻过程中免受致命伤害。

三、标准配方与配制方法

最经典和通用的配方是：

   90% 完全细胞培养液
       例如：DMEM, RPMI-1640等，并含有血清（如10-20% FBS）或血清替代物。
       作用：提供细胞在冻存和复苏后所需的营养物质和生长因子。
   10% DMSO
       这是经过长期实践验证的、对大多数细胞系安全有效的浓度。
       注意：必须使用细胞培养级别的高纯度、无菌DMSO。

配制方法：
1.  取适量完全培养液（预冷至4°C为佳）。
2.  加入所需体积的DMSO，轻轻混匀。
3.  关键：冻存液需现用现配，或配制后分装保存于-20°C，避免反复冻融和长期存放。
4.  注意：DMSO在溶解时会放热，最好在冰浴或低温环境下操作，以保护培养液中的蛋白质和生长因子。

四、标准冻存流程（逐步降温）

正确的降温速度至关重要，通常使用程序降温盒或“慢冻” 的方法。

1.  细胞准备：取处于对数生长期、状态良好的细胞。
2.  消化与重悬：用胰酶消化细胞，用含血清的培养液终止消化，吹打成单细胞悬液。
3.  离心与计数：离心去除旧培养液，用适量预冷的冻存液重悬细胞，调整细胞密度至 \(5 \times 10^6\) 至 \(1 \times 10^7\) 个/mL。
4.  分装：将细胞悬液分装到无菌的冻存管中，每管1.0-1.5 mL。拧紧管盖，并用封口膜密封。
5.  逐步降温：
       最佳方法：使用程序降温盒，将其直接放入-80°C冰箱。这种盒子能提供大约-1°C/分钟的理想降温速率。
       传统方法：若无程序降温盒，可采用“悬空法”：
           4°C 冰箱，30分钟
           -20°C 冰箱，2小时
           -80°C 冰箱，过夜
6.  长期保存：经过逐步降温后，尽快将冻存管转移至液氮 中长期保存。在-80°C中只能进行短期保存（数月）。

五、复苏流程

复苏的原则是 “快融”，以快速通过对细胞最危险的温度区间（-50°C至0°C）。

1.  快速解冻：从液氮或-80°C中取出冻存管，立即放入37°C水浴中，不断摇晃使其在1-2分钟内完全融化。
2.  转移与稀释：用酒精擦拭冻存管消毒后，在超净工作台中打开，将细胞悬液转移至含5-10mL完全培养液的离心管中。这一步是为了稀释DMSO，减轻其毒性。
3.  离心：以低速（如1000-1200 rpm）离心5分钟，弃去上清液，去除DMSO。
4.  重悬与培养：用新鲜的完全培养液重悬细胞沉淀，接种到培养皿中，放入37°C培养箱。

六、注意事项与常见问题

   DMSO的毒性：DMSO在室温下对细胞有毒性。因此，冻存液在加入细胞后，应尽快开始降温程序；复苏后应尽快离心去除。
   血清的选择：对于无血清培养的细胞或临床应用的细胞，可以使用无血清冻存液（商业产品），它们通常用糖类（如海藻糖）和其他大分子聚合物来代替血清的保护作用。
   细胞密度：密度过高或过低都会影响复苏存活率。
   无菌操作：全程保持无菌，避免污染。

 总结

DMSO细胞冻存液是细胞生物学研究的基石技术。 其核心在于利用DMSO作为冷冻保护剂，通过慢冻和快融的标准流程，最大限度地保证细胞的存活率和功能。掌握其原理和规范操作，是成功进行细胞保种和资源库建设的关键。对于新手，强烈建议使用程序降温盒来简化步骤并确保成功率。

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