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技术资料/正文
EZB miRNA加尾法逆转录试剂盒原理
109 人阅读发布时间：2024-08-22 09:59
EZB miRNA加尾法逆转录试剂盒，来自EZB公司（公司全称EZBioscience），下面让我们来详细了解一下加尾法吧！
成熟的miRNA的长度只有20nt左右，通常正向引物就会覆盖其全长甚至会有多余部分，反向引物就无处安置了。目前市面上解决方案就是在反转录时设法增加反转录产物长度。常见的方法有加尾法和茎环法，可以根据不同需求选择。
二、EZB miRNA加尾法逆转录试剂盒原理
EZB miRNA加尾法，利用PolyA 聚合酶为成熟的miRNA加上PolyA 尾，以带有通用序列的Oligo-dT作为反转录引物，合成加长miRNA对应的cDNA第一链。加尾法由PolyA聚合酶和逆转录酶两个酶共同作用完成。PolyA聚合酶负责给miRNA加上PolyA尾，增加其长度。之后逆转录引物结合到PolyA序列上，由逆转录酶完成加长版cDNA的合成。
三、EZB miRNA加尾法正向引物的设计
① 建议根据完整miRNA序列设计miRNA正向特异性引物，并将其中的U替换为T。
② 由于决定miRNA特异性的差异碱基大多都在3’端，同家族的miRNA基本在5’端序列相近，若根据miRNA序列设计的正向特异性引物退火温度过低，建议在引物5’端增加几个碱基（以G和C为主），增加碱基后需要验证一下特异性是否发生变化，以免造成非特异性扩增。如果出现引物退火温度过高的情况，建议删去5’端几个碱基。
③ 对于miRNA前体等长片段非特异性扩增，建议在正向特异性引物3’端增加1 ~ 3个A碱基。因为miRNA前体的部分序列和miRNA的序列是一样的，唯一的区别就是Poly（A）聚合酶发挥作用之后，miRNA序列后有连续A碱基组成的PolyA尾，而miRNA前体中与miRNA一致的序列后面不是连续的A碱基。在后续定量时，上游引物3’端增加1 ~ 3个A碱基可以避免miRNA前体的非特异扩增。
④ 对于序列相似的miRNA，决定其特异性的差异碱基大多都在3’端，建议正向特异性引物3’端需要终止于差异碱基，若由于引物长度过短而导致退火温度过低，可在引物5’端增加几个碱基，使上下游引物Tm值匹配。
四、部分EZB产品列
一、EZB miRNA介绍
miRNA，全名MicroRNA，是一种大小约21-23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。miRNA主要与靶基因mRNA3’端非编码区域特异性结合，调控转录后靶基因mRNA的翻译过程，从而阻断mRNA翻译和促进mRNA降解导致蛋白质表达降低。 miRNA的作用涉及个体发育、组织分化、细胞增殖和细胞凋亡等多种心血管疾病的发生发展。成熟的miRNA的长度只有20nt左右，通常正向引物就会覆盖其全长甚至会有多余部分，反向引物就无处安置了。目前市面上解决方案就是在反转录时设法增加反转录产物长度。常见的方法有加尾法和茎环法，可以根据不同需求选择。
二、EZB miRNA加尾法逆转录试剂盒原理
EZB miRNA加尾法，利用PolyA 聚合酶为成熟的miRNA加上PolyA 尾，以带有通用序列的Oligo-dT作为反转录引物，合成加长miRNA对应的cDNA第一链。加尾法由PolyA聚合酶和逆转录酶两个酶共同作用完成。PolyA聚合酶负责给miRNA加上PolyA尾，增加其长度。之后逆转录引物结合到PolyA序列上，由逆转录酶完成加长版cDNA的合成。
三、EZB miRNA加尾法正向引物的设计
① 建议根据完整miRNA序列设计miRNA正向特异性引物，并将其中的U替换为T。
② 由于决定miRNA特异性的差异碱基大多都在3’端，同家族的miRNA基本在5’端序列相近，若根据miRNA序列设计的正向特异性引物退火温度过低，建议在引物5’端增加几个碱基（以G和C为主），增加碱基后需要验证一下特异性是否发生变化，以免造成非特异性扩增。如果出现引物退火温度过高的情况，建议删去5’端几个碱基。
③ 对于miRNA前体等长片段非特异性扩增，建议在正向特异性引物3’端增加1 ~ 3个A碱基。因为miRNA前体的部分序列和miRNA的序列是一样的，唯一的区别就是Poly（A）聚合酶发挥作用之后，miRNA序列后有连续A碱基组成的PolyA尾，而miRNA前体中与miRNA一致的序列后面不是连续的A碱基。在后续定量时，上游引物3’端增加1 ~ 3个A碱基可以避免miRNA前体的非特异扩增。
④ 对于序列相似的miRNA，决定其特异性的差异碱基大多都在3’端，建议正向特异性引物3’端需要终止于差异碱基，若由于引物长度过短而导致退火温度过低，可在引物5’端增加几个碱基，使上下游引物Tm值匹配。
四、部分EZB产品列
| 货号 | 产品 | 价格 |
| EZB-RN5 | Fast Tissue RNA Purification Kit | 询价 |
| EZB-TZ1 | Total RNA Extraction Reagent | 询价 |
| EZB-RN001A | Tissue RNA Purification Kit | 询价 |
| EZB-VRN1 | Viral RNA Purification Kit | 询价 |
| B0004D | EZ-press RNA Purification Kit | 询价 |
| EZB-RN4 | Universal RNA Purification Kit | 询价 |
| B0006 | EZ-press Whole Blood RNA Purification Kit | 询价 |
| B0009 | EZ-press DNA&RNA Purification Kit | 询价 |
| EZB-RN001 | Tissue RNA Purification Kit | 询价 |