Abcam有关ChIP的问题解答

Abcam有很多产品应用到了ChIP, 即染色质免疫共沉淀——换种说法，就是我们用抗体去“钓”特定的能结合DNA的蛋白质，我们最后检测的是和这蛋白质结合的DNA。下面让我们一起看看它的疑难问题如何解决吧!
                                                                                                       












1. 为什么要用甲醛交联?
甲醛交联是ChlP实验非常关键的一个步骤。因为甲醛交联能更好的保存蛋白与DNA的相互作用，除了用于检测组蛋白修饰分布的Native ChlP以外，其他的ChIP基本上都需要用甲醛交联。
甲醛作为交联剂有几个好处：(1)甲醛是一种非常活跃的小分子，它本身可以非常容易的穿过细胞膜及核膜进入细胞核，并通过醛基将DNA碱基上的氨基/亚氨基与蛋白的碱性氨基酸上的氨基/亚氨
基交联。(2)甲醛的交联是可逆反应，可以通过加热的方式解除交联，从而方便后续的DNA分析。
2. 甲醛交联有什么注意事项：
(1)甲醛交联用到的甲醛浓度和交联时间都是有严格要求的。一般的甲醛交联都选用1%的甲醛浓度，室温固定10～15分钟。时间太短的话，交联反应进行的不彻底，很多蛋白与DNA的结合不是很牢固，交联时间太长的话，会导致后续超声非常困难，而增加超声时间或功率会破坏目的蛋白本身的结构，进而导致ChIP结果不理想。
(2)在甲醛交联之前，细胞需要尽可能少被人为处理。如果条件允许的话，直接将甲醛加入培养基或将细胞培养基吸弃并换成含有1%甲醛的PBS交联会比胰酶消化细胞以后再交联更好一些。
(3)甲醛交联反应结束之后，需要马上加入相对甲醛过量的甘氨酸(一般甘氨酸终浓度为125 mM)与甲醛反应，终止交联反应。
(4)终止交联之后，样本需要经过PBS清洗(如果细胞数量比较少的话，可以在PBS里加入0.1%~0.5%NP-40,这样细胞在转移时不会粘在管壁或培养皿上),细胞沉淀可以直接用液氮速冻，然后置于-80摄氏度长期保存。
(5)组织的交联相比细胞交联要复杂一些。虽然甲醛可以很容易的透过细胞，但是大的组织块还是不太容易交联的很均一，所以大的组织块交联之前需要切成小块。一般建议用两个刀片将组织块切成1~3mm³大小。
3. buffer有什么要求
IP的另外一个关键因素是buffer,这包括binding buffer(超声用buffer)和wash buffer。一般来说，选用的Buffer越剧烈，背景DNA去除的就会越干净，但同样的，目的DNA也会被更多的清洗掉。反之，选用的buffer越温和，目的DNA得到的就会越多，但同样的，背景DNA也就残留的越多。对于去垢剂来说，离子型去垢剂(如SDS,SDC)比非离子型去垢剂剧烈得多。对于盐来说，剧烈程度LiCl>NaCl>KCI。去垢剂的选择，盐和去垢剂的浓度都会对ChlP效果产生很大影响。很多实验室或公司在这方面都有自己独到的buffer配方。
4. 无特异性抗体对照时出现背景过高的原因
（1）与蛋白A或G非特异性结合，应采用预清除处理，即在加入抗体前，将裂解的样本与磁珠混合1小时然后分离使用。
（2）染色质免疫沉淀所用缓冲液被污染
裂解液和洗涤缓冲液要新鲜配制。
（3）某些蛋白A或G磁珠本身会产生很高的背景
某些蛋白A或G磁珠会有很高的背景。要找到一个合适的供应商，所提供的产品应在非特异性对照样本中得到背景最低最干净的结果。

货号	产品名称	规格
Ab500	ChIP Kit	1Kit
ab16833	Anti-MSH2 antibody - ChIP Grade	100ug
ab205698	ChIP Buffer	6ml

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