His tag的应用

一、His-tag是什么

单抗又叫6*His-tag单抗，或6*His单克隆抗体，用小鼠制备，His可被镍柱吸附，用于纯化重组蛋白，无论表达的蛋白是可溶的或者包涵体都可以用固定金属离子亲和层析（IMAC）纯化。金属螯合亲合层析，又称固定化金属离子亲合层析（Immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC），是近30年发展起来的一种新型分离技术。最早由Paroth等人提出。该方法利用蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸、色氨酸、半胱氨酸等能和金属离子发生特殊的相互作用的原理，从而对蛋白质加以分离。这些作用包括配价键结合、静电吸附、共价键结合，其中以配价键结合为主，而且这其中又以6组氨酸标签（His-Tag）应用最为广泛。His-tag是蛋白质重组技术中经常用到的一种标签，其序列为6个组氨酸HHHHHH，其特点是分子量小，只有不到0.84 KD，基本不改变蛋白质的生物结构，不改变蛋白质的溶解性，更重要的是它使蛋白质的纯化变得极为方便。根据组氨酸上的咪唑环可以与二价金属离子结合的原理，His-Tag 可结合在目的蛋白的 C 末端或 N 末端，形成特殊的结构，以便于进行下一步的纯化及检测。人们可以利用金属离子亲和层析技术纯化带有His标签的蛋白，即将含有目的蛋白的裂解液通过固定的二价金属离子（通常是二价Ni离子）填料，带有6*his-tag的蛋白质即与填料结合，其它蛋白不与填料结合，最后再用高浓度的咪唑即可将目的蛋白洗脱下来。

以实验小鼠为宿主制备的His-tag单抗叫His-tag鼠单抗。其制备方法通常是这样的：人工合成6*His多肽，即氨基酸序列为HHHHHH的多肽，必要时在末端添加偶联载体用到的特殊氨基酸。合成好此多肽后，通过化学方法将此多肽与载体蛋白偶联（如KLH、BSA、OVA等），偶联完成后，再用偶联好的全抗原免疫实验小鼠，免疫结束后杀死免疫好的小鼠，无菌条件下取脾脏，与骨髓瘤细胞进行融合，用ELISA或者其它手段进行筛选出阳性的克隆，筛选到的细胞经过克隆化后即形成稳定的细胞株，将此细胞株进行体外培养或小鼠体内诱生腹水形成，再从培养基或者腹水中纯化即可得到His-tag鼠单抗，再用Western blot或其它手段进行鉴定即可。

二、His tag的衍生

目前，很多商业公司研发出His tag融合重组蛋白表达纯化系统的系列产品，从重组蛋白表达载体构建到纯化填料，以及该系列产品的标准化操作流程，都有保姆级的使用教程和非常完善的指导体系。但是，这些流程只对初学者扫盲有用，真正的有经验的蛋白纯化人员不应仅仅拘泥于此。一分钟学会的如此简单His tag重组蛋白纯化技术，遇到的问题大抵是让你一年欲哭无泪，爱而不得：明明看到蛋白表达，却是纯不下来，或者纯下来的杂蛋白比目标蛋白还多，喧宾夺主。这些商业化的表达载体上的蛋白表达单元框内一般会设计连续的6个His(6xHis)在N-端或者C-端，或者两端都有；当我们将目标蛋白基因通过多克隆位点（Multiple Cloning Site, MCS）插入达到表达载体的时候，可以构建出N-端、C-端或者两端都带6xHis标签的融合蛋白。基因合成技术如此发达的今天，谁还过度依赖于载体上那几个His标签的有无和位置，目标基因的插入谁还拘泥于多克隆位点的那几个限制酶切位点憋屈，谁还局限于那老套的6XHis？就像考试时永远觉得自己好像没学过，在此基础上，研究人员设计出各种His tag的衍生玩法。

HQ tag

HQ tag标签的序列是HQHQHQ，是在6XHis tag的基础上间隔着将氨基酸His改编为Gln, Becky Godat,等人在2008年的《 Affinity Chromatography_ Methods and Protocols》这本书的一个章节里描述了这个标签，书中没有明确指出它比6XHis tag优势之处，但如果非要找出其优势点：分子量更小，在更低的咪唑浓度(50mM)浓度下可以洗脱HQ tag融合目标蛋白，低浓度的咪唑对蛋白更友好（高浓度的咪唑更容易使蛋白质聚集），也更利于目标蛋白的下游实验，特别是酶活实验。

携带HQ tag的商业化载体Flexi® Vectors出自promega这个公司，百度搜索关键词“HQ tag”，搜索结果第一条就是promega公司的Flexi® Vectors信息。

6X HN tag

6X HN标签（HN tag）是His与Asn形成小单元（HN）连续重复6次,即（HN）₆，它与6XHis标签相比，其与金属离子结合力更强一些，关于这个标签的文献相对较少。

Clontech(Takarabio)公司研发出pET6xHN Expression Vector产品，并申请了相关专利，专利号US7176298。

HAT tag

HAT tag是一种新型阳离子亲和标签，源自鸡乳酸脱氢酶，氨基酸序列为KDHLIHNVHKEEHAHAHNK，它包含六个His，与其他氨基酸残基不均匀交错分布。HAT tag与 His tag相比,它是一种无电荷分布偏差的可溶性蛋白质，因此，HAT tag融合蛋白具有更好的溶解性。不但如此，HAT tag中His的不均匀交错排列使其具有更高的可及性，能更有效与固定化的金属离子结合。HAT tag融合蛋白可以在中性pH下与固定化的金属离子结合吸附，此中性溶液环境下，细胞裂解物中存在的碱性蛋白酶活性较低，利于大多数蛋白质稳定和活性保持。

三、His-tag相关产品推荐

货号	产品名称	品牌
11285-MX	RD重组猴痘病毒A35R His-tag蛋白	R&D
11282-MX	RD重组猴痘病毒A30L His-tag蛋白	R&D
11277-MX	RD重组猴痘病毒H3L His-tag蛋白	R&D