siRNA转染实验如何做

一、siRNA介绍

小干扰RNA（Small interfering RNA；siRNA）有时称为短干扰RNA（short interfering RNA）或沉默RNA（silencing RNA），是一个长20到25个核苷酸的双链RNA，在生物学上有许多不同的用途。已知siRNA主要参与RNA干扰（RNAi）现象，以带有专一性的方式调节基因的表达。此外，也参与一些与RNAi相关的反应途径，例如抗病毒机制或是染色质结构的改变。不过这些复杂机制的反应途径尚未明了。产品通常以冻干粉的形式运输，使用前需要进行瞬时离心，然后用RNase-free H2O或灭菌ddH2O配制成2OμM的储存液。配制好的液体需要分装保存，并避免反复冻融，建议次数不超过5次，以确保siRNA的稳定性和活性。

二、材料准备:

6个0.5ml的EP管，1个2ml的EP管，无酶枪头，提前回温的培养基，锡箔纸（特别是对于荧光siRNA需要避光），以及无抗培养基10ml。

三、转染步骤:

(INTERFERin 转染剂,6孔板,转染浓度50nM)

1.接种细胞：预处理细胞：在进行转染前24小时，将2-4×10^5个细胞接种在2ml基础培养基中，转染时细胞融合度应控制在30%至50%之间。在转染前一晚，使用不含抗生素和血清的培养基进行细胞饥饿处理，以避免血清中的蛋白质对实验的干扰。

2.将5μL siRNA在250μL Opti-MEM稀释，使最终转染浓度达到50nM，轻轻吹吸3至5次混匀。在使用转染剂INTERFERin之前，进行5秒的涡旋搅拌。随后将10μL INTERFERin转染剂直接添加到A液中，再次涡旋10秒使其均匀混合，室温下孵育10至20分钟，以形成siRNA和转染剂之间的复合物（不超过30分钟）。

3.在转染的复合过程中，除去原有的孔板培养基，需要每个孔中加入100-200μL新鲜的培养基。这一步骤非常关键，因为新鲜培养基的添加可以帮助细胞在转染过程中更好地生长和接受siRNA。

4.将siRNA转染复合物加入到6孔细胞板中时，要确保每个孔中添加260μL的复合物，并在加入之后轻轻摇晃细胞板，使复合物充分均匀混合。这样可以确保每个细胞都能受到充分的siRNA转染。

5.将处理好的细胞板置于37°C、5%CO2的培养箱中培养18-48小时，在转染后的4到6小时内可以考虑更换新鲜的培养基（建议更换含有血清的培养基）。这样可以帮助细胞在接受siRNA后继续稳定生长并发挥作用。