脆弱的RNA如何更完整？

92 人阅读发布时间：2024-09-23 16:04

一、前言

FFPE是癌症研究中一类常见的样本，但其样本制备和储存过程会因高温孵育、暴露氧化、核酸及蛋白分子间的交联、染色等导致其中的核酸质量下降，这对于本身就容易发生降解的RNA来说，高质量的RNA获取则更是难上加难。因此，RNA质量的提高，需要从前期组织样本获取、固定到石蜡包埋的每一环节入手。今天我们就带着大家进行逐步的详细分析，期待能够帮助大家从FFPE样本中得到高质量的RNA。

二、固定、包埋及染色环节注意事项

为了尽量降低核酸断裂和交联的程度，在使用福尔马林固定时应注意:

尽可能使用新鲜的组织样本，在离体后30分钟内尽快使用4-10%的中性缓冲福尔马林进行固定。
组织样本厚度应尽量小于5mm，以便福尔马林完全渗透。
固定时长保持在12-24小时之间，时间过长会导致严重的核酸片段断裂，影响下游检测的性能；固定时间过短则会导致深处组织因未接触到福尔马林而出现核酸和蛋白质降解，或基因表达发生变化。
包埋前需将样本彻底脱水，并尽量使用熔点低的石蜡，避免在浸蜡过程中因温度升高而导致核酸和蛋白质降解，温度尽量不要超过 60℃。
FFPE切片的染色可能会损害RNA的质量和性能，目前已证明使用甲酚紫染色对下游实时RT-PCR分析的性能影响最小，针对需要提取RNA的切片建议使用甲酚紫染色。

三、FFPE样本提取RNA的步骤

FFPE样本中核酸的提取通常分为脱蜡、蛋白酶K处理及解交联步骤，核心目的在于将样本中与蛋白质已发生交联的核酸分子进行充分的释放，并尽量确保核酸分子的完整性。

四、如何脱蜡更有效？

在进行脱蜡前，应先观察石蜡切片样本的实际情况。如果由组织组成的表面积小于30%，可以在开始核酸提取之前使用手术刀去除多余的石蜡。目前最为常用的是采用二甲苯进行脱蜡，因具有较强的溶解性能，不需要高温条件，能够降低脱蜡过程对FFPE样本造成损伤，是目前使用较为普遍的脱蜡方法。然而，二甲苯具有较强的毒性，不仅提高了实验操作环境的要求，也会对操作人员的健康构成潜在危险，因此推荐采用环保无毒的脱蜡液进行替代。来自QIAGEN的Deparaffinization Solution脱蜡液是一款优秀的无毒非有机型脱蜡液，能够便捷、高效的完成脱蜡过程，保障后续核酸提取实验的高效进行；在脱蜡过程结束后，无需专门将其进行去除，也不影响后续蛋白酶K的消化步骤，不仅简化、缩短了处理的步骤和时间，也避免了核酸的损失，确保了更高的核酸提取产量。

五、既要解交联又要避免RNA片段化

FFPE样本在脱蜡后，需要在含有蛋白酶K的优化裂解缓冲液中进行适当时间、温度条件下的孵育裂解，以实现解交联从而释放RNA。较长的孵育时间或较高的孵育温度，可能导致更多的RNA碎片化，进而影响下游PCR或测序实验的效率。因此，如何在解交联效率和RNA片段完整性间找到平衡点至关重要。在专门针对FFPE RNA提取而开发的RNeasy FFPE Kit优化的操作流程中，推荐采用56°C孵育15分钟，然后再80°C孵育15分钟进行解交联。

六、RNeasy FFPE Kit

能够回收FFPE样本中所有大于70nt的RNA，优化的裂解缓冲液及特殊的孵育条件不仅通过高效的解交联使RNA得到充分释放，也能避免RNA 在纯化过程中的降解。