锁核苷酸LNA介绍

一、LNA的介绍

锁核酸（Locked nucleic acid，LNA）是一种经过修饰的RNA，LNA中一部分核糖上的2'与4'碳连结在一起。一般可见于A-DNA或RNA。这类核酸可以增加引物或探针（probe）的融解温度（Tm值），加强这些实验用物质的稳定性，可应用在即时聚合酶连锁反应（real-time PCR）等技术中。近期,锁核酸(locked nucleic acid,LNA)作为一种新颖的核苷酸衍生物在药学研究领域引起了人们的广泛关注,有希望成为分子水平治疗各种疾病的新突破口.它是一种特殊的双环状核苷酸衍生物,结构中含有一个或多个2 ′-O,4′-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖核酸单体,核糖的2′-O位和4′-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥,并连接成环形,这个环形桥锁定了呋喃糖C3′-内型的N构型,降低了核糖结构的柔韧性,增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性.由于LNA与DNA/RNA在结构上具有相同的磷酸盐骨架,故其对DNA、RNA有很好的识别能力和强大的亲和力.与其他寡核苷酸类似物相比,LNA有很多优点:a.和DNA、RNA互补的双链有很强的热稳定性(ΔTm=3～8℃);b.抗3′脱氧核苷酸酶降解的稳定性;c.LNA-DNA杂交物能激活RNase H;d.水溶性好,自由穿入细胞膜,易被机体吸收;e.体内无毒性作用;f.高效的自动寡聚化作用,合成方法相对简单,部分或完全修饰的LNA寡核酸链可用氨基磷酸法在DNA自动合成仪上合成.

 

 

二、LNA对核酸双链稳定性的影响研究

• LNA提高双链稳定性的作用

当杂交双链中包含有完全互补的LNA:DNA碱基对A:t, a:T, G:c或g;C时，它们的解链温度与相应的DNA-DNA双链相比提高了4.2-5.0℃。当LNA-DNA 双链中包含有两对LNA:DNA碱基对如C:g+ t:A或c;G + T:a,它们的解链温度分 别增高了7.7℃ 和7.1℃。当探针和靶标中各含有一个LNA碱基并可形成含有LNA:LNA碱基对A:T或G:C的完全互补的杂交双链时，杂交双链的解链温度与 相应的DNA-DNA双链相比分别提高了6.5℃ 和8.0℃。说明在对碱基对中LNA无论修饰哪个碱基，其作用都是相近的。这些结果显示，LNA修饰的探针可以提高杂交双链的稳定性。

• LNA:DNA 错配碱基对的热稳定性

LNA:DNA错配对双链稳定性的破坏作用要大于DNA:DNA错配。其中C:c 和C:t 错配是所有LNA:DNA错配中最不稳定的碱基对，而c:c和c:t错配是所有DNA:DNA错配中最不稳定的碱基对，T:g和t:g对双链稳定性破坏的作用是最小的。并且N:m错配和n:M错配对双链稳定性破坏的作用有很大的不同。

• 含有一个LNA:DNA互补碱基对和一个DNA:DNA错配碱基对的双链的热稳定性

随着错配位点逐渐靠近双链的末端，错配对双链稳定性的破坏作用逐渐减弱。另外，双链稳定性主要取决于错配碱基对的类型，而与错配距LNA:DNA互补碱基对的距离无明显关系。

• 靶标链上发生单碱基插入时LNA-DNA双链的稳定性

若对杂交双链进行单个碱基的LNA修饰，当双链发生单碱基插入时，插入对LNA-DNA双链稳定性的破坏作用要大于DNA-DNA双链，说明LNA碱基对插入的识别能力高于DNA碱基。LNA碱基修饰鸟嘌呤比修饰胞嗜啶时，对插入的识别能力更强。

三、LNA在基因检测中的应用

• LNA引物

用锁核酸修饰引物大大提高了PCR的效率。PCR上游引物的3'末端经LNA修饰后，若3"末端与模板不是互补的，则PCR扩增效率明显降低，即LNA修饰的引物其识别错配的能力与DNA引物相比大大提高。普通PCR实验也证明LNA引物可产生较少的错配产物，而DNA引物与模板发生错配时却有大量的错误产物扩增出。与普通的DNA引物相比，LNA引物所用聚合酶用量少,成本效率高。除此之外,LNA引物还可以减少模板用量。研究发现，在引物中间修饰一个或三个锁核酸效果最佳。将锁核酸修饰在引物的3'端或5 '端或其他的位点,PCR结果显示，锁核酸修饰在引物5'端优势更明显。

• LNA探针

LNA(Locked Nucleic Acid)探针是一种用于核酸检测和分析的高效探针，具有增强的特异性和稳定性。它们通常被用于实时聚合酶链式反应(real-time PCR)、原位杂交、基因表达分析等核酸分子生物学技术中。LNA探针的特殊之处在于它们的核酸结构中包含了Locked Nucleic Acid,即一种经过修饰的核酸单元。LNA中的核苷酸具有特殊的构象，其中的核苷酸环被修饰以形成一种特殊的结构，使其能够更强烈地结合目标DNA或RNA。在基因表达分析中，LNA探针可用于检测特定基因的表达水平。通过与目标基因杂交，LNA探针能够准确地检测出基因的表达量，从而帮助研究人员确定基因的表达模式。这有助于揭示基因的功能和疾病的发生机制。突变检测是LNA探针应用的另一个重要领域。LNA探针可以与目标DNA序列进行高亲和力结合，从而准确地检测出突变的存在。这有助于对疾病进行早期诊断和治疗方案的制定。LNA探针还可以用于基因定位和疾病诊断。通过与染色体杂交，LNA探针可以准确地检测和定位特定基因或染色体片段。这有助于确定基因的位置和功能，同时也有助于疾病的诊断和治疗。

提高 qPCR 探针的热稳定性。掺入LNA核苷酸后，由于LNA在错配位点形成Watson-Crick碱基对的倾向更强烈，因此qPCR探针通过单核苷酸多态性（SNP）区分等位基因的能力会大大增强。热变性研究表明，当LNA 掺入在寡核苷酸的特定位置时，完美匹配和错配之间的 Tm 值存在显著差异。因此，在 SNP 测定中，与天然状态DNA探针相比，LNA qPCR探针杂交具有更强的不稳定性，因此能够更好地区分出错配。

 

由于可以使用LNA调整qPCR探针的Tm值，因此可以获得具有不同GC 含量的几个短序列的标准化Tm值。例如，富含AT的天然状态DNA qPCR探针通常需要超过30个碱基长（有时需要超过 40个）以满足扩增子设计指南，但仍有可能表现不佳。使用LNA qPCR探针，通过选择性定 位LNA核苷酸，有助于产生最佳的、具有高度特异性的短探针。较窄的Tm值范围对于微阵列和多重PCR应用特别有益，特别是当探针必须在相同条件下与许多不同靶标的同时结合时。